Genetik Hasarı Mikroskop Altında Görmek: Mikronükleus Testinin Gücü ve Geleceği

Mikronükleus (MN) Testi Nedir?

Mikronükleus testi, hücre bölünmesi sırasında meydana gelen kromozomal kırıklar veya tüm bir kromozomun mitoz sırasında hücre kutuplarına düzgün şekilde ayrılamaması sonucu oluşan, çekirdek dışında bulunan küçük çekirdekçiklerin (mikronükleusların) mikroskobik olarak sayılması esasına dayanan bir sitogenetik analiz yöntemidir. Bu küçük çekirdekçikler, genetik materyaldeki bozulmaların doğrudan göstergesi olup genotoksisite analizlerinde yüksek duyarlılık sunar. İlk olarak lenfositler üzerinde uygulanmaya başlanan bu test, zamanla hem in vitro hem de in vivo sistemlerde yaygın bir şekilde kullanılmaya başlanmıştır. Mikronükleusların varlığı, hücrede kalıcı genetik hasarların varlığına işaret ettiğinden dolayı, bu test genellikle potansiyel mutajenik ve klastojenik ajanların belirlenmesinde kullanılır.

Şekil 1. Mikroskop görüntüsünde polikromatik eritrosit (PCE) hücresi içerisinde yer alan mikronükleus (MN) yapısı ok ile gösterilmiştir. Mikronükleus, hücre bölünmesi sırasında DNA hasarına bağlı olarak ana çekirdekten ayrı oluşan küçük çekirdekçiklerdir. Bu yapılar, genotoksik ajanların neden olduğu kromozomal hasarın göstergesi olarak değerlendirilir. Mikronükleus testi kapsamında yapılan sayımlar, bu tür yapılar üzerinden yapılır ve test edilen ajanın genetik düzeydeki etkileri hakkında bilgi sağlar.

Testin Amacı ve Önemi

Mikronükleus testi, toksisite çalışmalarında yaygın olarak kullanılan, özellikle DNA’ya zarar verebilecek kimyasal, fiziksel veya biyolojik ajanların tespiti amacıyla geliştirilen bir yöntemdir. Testin temel amacı; genetik materyalde oluşan hasarları tespit ederek, söz konusu ajanın genetik düzeyde yol açabileceği olumsuz etkileri öngörmek ve bu etkilerin organizma genelinde yaratabileceği riskleri değerlendirmektir. Bu yönüyle mikronükleus testi, kanser araştırmalarında, ilaç geliştirme süreçlerinde, endüstriyel kimyasalların güvenlik analizlerinde ve çevresel toksikolojide kritik öneme sahiptir. Ayrıca mutajenite analizlerinin en temel parçalarından biri olarak, regülasyonlara girecek ürünlerin onay süreçlerinde de sıklıkla talep edilmektedir.

Hastanelerde Kullanımı

Mikronükleus testi, hastanelerde yaygın olarak kullanılan bir rutin tanı testi değildir. Ancak bazı durumlarda, özellikle radyasyona maruz kalan bireylerin genetik hasar düzeylerinin izlenmesi, kemoterapi veya radyoterapi gören hastalarda DNA hasarının saptanması ve genetik hastalıklar üzerine yapılan bilimsel araştırmalar kapsamında kullanılabilmektedir. Örneğin Fanconi anemisi gibi DNA onarımında bozukluklara yol açan kalıtsal hastalıkların araştırılmasında yardımcı test olarak değerlendirilebilmektedir. Klinik uygulamalardaki sınırlılığı, testin yüksek uzmanlık ve zamana dayalı mikroskobik inceleme gerektirmesi, hasta başı test olarak uygulanamaması ve genellikle araştırma düzeyinde kalmasıyla ilişkilidir.

Deney Hayvanlarında Kullanımı ve Önemi

Şekil 2. Mikronükleus testi için örnekleme aşamasında kullanılan rat femur kemiği. Testin in vivo uygulanmasında genellikle bu kemikten elde edilen kemik iliği tercih edilir. Femur, yoğun hücre bölünmesi gösteren kemik iliği yapısıyla, genetik hasar tespitinde yüksek duyarlılık sağlar. Görselde, disseke edilerek izole edilen femur kemiği, üzerindeki kas dokularından arındırılmış ve kemik iliği çıkarımına hazır hale getirilmiştir. Bu aşama, MN test protokolünde ilk basamak olan örnek hazırlığı açısından kritik öneme sahiptir.

Mikronükleus testi, in vivo sistemlerde özellikle sıçan ve fare gibi kemirgenler üzerinde yaygın olarak uygulanmaktadır. Deney hayvanlarında yapılmasının temel nedenlerinden biri, test edilecek ajanın canlı organizma üzerindeki sistemik etkilerinin bütüncül bir şekilde değerlendirilebilmesidir. İn vivo sistemlerde organizmanın metabolik sistemi çalıştığı için, toksik maddenin metabolitlerinin oluşturabileceği DNA hasarı da gözlemlenebilir. Bu özellik, in vitro sistemlerde gözden kaçabilecek etkilerin ortaya konulmasını sağlar. En sık kullanılan dokular ise kemik iliği ve periferik kandır. Kemik iliği, hızla bölünen hücre popülasyonuna sahip olması nedeniyle mikronükleus testinin duyarlılığını artırır. Periferik kan ise daha az invaziv bir yöntem olarak, hayvan refahı açısından avantaj sağlar. OECD tarafından yayımlanan Test Rehberi 474, in vivo mikronükleus testinin uluslararası standartlara uygun şekilde uygulanmasına olanak tanır.

Boyama, Sayım ve Değerlendirme Süreci

Test protokolü kapsamında, deney hayvanlarından elde edilen kemik iliği örnekleri belirli bir besiyeri içinde süspanse edilir, santrifüj ile hücreler ayrıştırılır ve yayma preparatlar hazırlanır. Hazırlanan lamlar, May-Grünwald ve Giemsa gibi klasik sitolojik boyalarla boyanarak mikroskop altında incelenir. Sayım işlemi genellikle immersiyon yağı kullanılarak 1000 adet polikromatik eritrosit (PCE) üzerinden yapılır. PCE hücreleri içerisinde gözlenen mikronükleus sayısı, test edilen maddenin genotoksik potansiyelini belirlemede kullanılır. Ayrıca, normokromatik eritrosit (NCE) hücrelerinin oranları da değerlendirilerek kemik iliği baskılanması gibi sistemik toksik etkiler de göz önünde bulundurulur.

Gelecekte Mikronükleus Testi ve Bilimsel Değeri

Günümüzde artan çevresel kirlilik, genetik hastalıklar ve kanser vakaları göz önüne alındığında, genetik toksisite testlerinin önemi giderek artmaktadır. Mikronükleus testi, bu bağlamda genetik stabilitenin korunması, zararlı ajanların erken teşhisi ve toplum sağlığının korunmasına yönelik bilimsel bir kalkan işlevi görmektedir. Aynı zamanda genom stabilitesine dair verilerin artmasıyla birlikte, yaşlanma, immün sistem bozuklukları, nörodejeneratif hastalıklar ve çeşitli çevresel etkileşimlerin anlaşılmasında da mikronükleus verilerinden yararlanılmaktadır. Yeni nesil teknolojilerin (örneğin otomatik MN sayımı yapan sistemlerin) gelişmesi, testin daha hızlı, güvenilir ve yüksek kapasiteli hale gelmesini sağlayarak araştırmalarda daha yaygın bir şekilde kullanılmasına olanak tanımaktadır. Sonuç olarak, mikronükleus testi, bilimsel literatürdeki gücünü koruyan, gelecekte daha da değer kazanacak bir genotoksisite analiz yöntemi olarak karşımıza çıkmaktadır.

---

Referans

• Rjiba-Touati, K., Ayed-Boussema, I., Skhiri, H., Belarbia, A., Zellema, D., Achour, A., & Bacha, H. (2012). Induction of DNA fragmentation, chromosome aberrations and micronuclei by cisplatin in rat bone-marrow cells: protective effect of recombinant human erythropoietin. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 747(2), 202-206.

  
  

• Bowen, Damian E., et al. "Evaluation of a multi-endpoint assay in rats, combining the bone-marrow micronucleus test, the Comet assay and the flow-cytometric peripheral blood micronucleus test." Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 722.1 (2011): 7-19.

  
  

• Schmid, W., (1975). The Micronucleus Test. Journal Mutation Research, 31, 9-15.